Chuyển tới nội dung
Home » Giữ Giống Vi Sinh Vật Bằng Glycerol | Credits Given To Parafilm®

Giữ Giống Vi Sinh Vật Bằng Glycerol | Credits Given To Parafilm®

kĩ thuật phân lập và bảo quản giống vi sinh vật thuần khiết nhóm 2

Các phương pháp bảo quản chủng vi sinh vật

Trong phần này, các phương pháp được dùng chung cho các đối tượng vi sinh vật chính (vi khuẩn, nấm sợi, nấm men, xạ khuẩn, vi tảo).

Phương pháp cấy truyền vi sinh vật:

Đây là phương pháp bảo quản đơn giản, các chủng vi sinh vật được cấy trên môi trường thích hợp (dịch thể hay trên thạch) trong ống nghiệm hay bình tam giác và để trong điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển. Sau đó các chủng vi sinh vật này được chuyển đến nơi bảo quản có nhiệt độ thích hợp. Quá trình này được lặp lại trong một thời hạn nhất định, đảm bảo chủng vi sinh vật luôn được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết. Thực tế có nhiều chủng vi sinh vật thích hợp với phương pháp bảo quản này như: Staphylococi,Coliform… có thể sống được vài năm theo cách này. Cho dù phương pháp này là phương pháp khá phổ biến được dùng trong các cơ sở nghiên cứu và sử dụng các chủng vi sinh vật đặc biệt là các chủng đang dùng cho nghiên cứu. Tuy nhiên, phương pháp này cũng bộc lộ nhiều nhược điểm sau:

  • Dễ bị tạp nhiễm và dễ dẫn đến mất chủng giống gốc.
  • Mất hay nhầm lẫn nhãn hiệu giữu các chủng trong quá trình bảo quản.
  • Phải nghiên cứu và theo dõi thời gian cấy truyền thích hợp đối với các chủng bảo quản.
  • Tốn nhiều công sức để cấy truyền.
  • Giống gốc có thể mất do sai sót khi dùng môi trường cấy truyền không thích hợp.
  • Chủng vi sinh vật cấy truyền dễ bị thay đổi các đặc điểm sinh học do đột biến xuất hiện sau mỗi lần cấy truyền.
* Phương pháp làm mất nước trong môi trường bảo quản:

Phương pháp này thường dùng cho các chủng nấm sợi và nấm men. Theo phương pháp này các chủng vi sinh vật có thể được bảo quản với các chất mang phổ biến như sau:

  1. Trên đất, cát và silicagel. Các nghiên cứu cho thấy là bào tử nấm có thể sống 4-5 năm khi bị làm khô trong đất mà không bị thay đổi các đặc tính sinh học. Ngày nay silicagel là chất mang được dùng phổ biến và có hiệu quả đối với bảo quản nấm men, nấm sợi.
  2. Bảo quản trên giấy: Các chủng nấm men và nấm sợi được làm khô trên giấy và sau đó được bọc bằng giấy bạc và đựng trong hộp kín. Ưu thế của phương pháp này là bảo quản được lượng mẫu lớn.
  3. Bảo quản trên gelatin: Để thực hiện phương pháp này, người ta tạo dịch huyền phù chủng vi sinh vật trong môi trường có gelatin. Sau đó các giọt mẫu được làm khô trong đĩa petri. Phương pháp này có thể bảo quản được vi khuẩn trong vài năm.

Nhìn chung, không có phương pháp nào là vạn năng cho bảo quản các nhóm vi sinh vật khác nhau. Thực ra là rất khó khi đánh giá một cách đầy đủ xét theo mọi yêu cầu đã được đặt ra ở trên. Chính vì vậy mà các phương pháp bảo quản phải được kiểm nghiệm thực tế với từng loại vi sinh vật, từ kết quả đó có thể chọn ra phương pháp thích hợp hoặc đồng thời sử dụng các phương pháp khác nhau.

Phương pháp đông khô vi sinh vật và phương pháp đông khô trực tiếp

2.Phương pháp đông khô:

Đông khô là quá trình mà nước được lấy ra khỏi mẫu khi các mẫu đang ở trạng thái lạnh sâu. Ở đây vi sinh vật được huyền phù trong môi trường thích hợp và được làm lạnh trong môi trường chân không. Thiết bị đông khô sẽ hút nước và cuối cùng mẫu được làm khô đến mức nhất định. Mẫu được hàn kín để cho môi trường chứa mẫu là chân không. Đây là phương pháp phổ biến có hiệu quả cao cho bảo quản các đối tượng vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn và một số virut. Tuy nhiên, phương pháp này ít được ứng dụng đối với tảo, động vật nguyên sinh và tế bào động vật.

2.Phương pháp đông khô dịch thể trực tiếp (L-drying):

Ngoài phương pháp đông khô như mô tả ở trên, còn có phương pháp đông khô trực tiếp. Khác biệt với phương pháp trên ở chỗ dịch huyền phù vi sinh vật được làm khô nhanh ở chế độ chân không thích hợp mà mẫu không cần làm lạnh từ trước. Phương pháp này đặc biệt có ý nghĩa đối với nhóm vi khuẩn không có khả năng sống trong nhiệt độ thấp của giai đoạn tiền đông. Các thông số quan trọng cần được quan tâm khi thực hiện phương pháp này là:

  • Tuổi của chủng vi sinh vật bảo quản.
  • Thành phần dịch huyền phù tế bào vi sinh vật.
  • Tốc độ đông khô.
  • Nhiệt độ đông khô thấp nhất.
  • Khoảng thời gian làm khô mẫu và độ ẩm cuối cùng của mẫu.

Phương pháp này nhanh và thuận lợi cho các đợt bảo quản số lượng lớn mẫu. Thông thường theo phương pháp này, chủng vi sinh vật được bảo quản từ 10-20 năm. Nói chung cả hai phương pháp này có nhiều ưu điểm so với các phương pháp trước như thời gian bảo quản lâu, tiết kiệm được công sức và sai sót nhãn mác và tạp nhiễm. Tuy nhiên, nhược điểm lớn nhất của phương pháp này là giá thành thiết bị. Độ ổn định của các chủng vi sinh vật bảo quản theo các đợt đông khô là khác nhau. Hơn thế nữa các chủng trước khi đem ra sử dụng phải được hoạt hoá trên môi trường thích hợp một số lần để phục hồi các đặc tính sinh học.

Phương pháp bảo quản lạnh sâu

Đối với phương pháp bảo quản lạnh sâu thì chủng vi sinh vật được bảo quản trong môi trường dịch thể và nước cần cho hoạt động sống của vi sinh vật bị bất hoạt ở nhiệt độ lạnh sâu (-196°C -> -80 °C).

Xem thêm: Principles of cryopreservation

Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu. Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích luỹ các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào. Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol, DMSO (dimethyl sulfoxide). Việc bảo quản theo phương pháp lạnh sâu này được thực hiện ở các thang nhiệt độ khác nhau như -20° C, -30° C, -40° C, -70° C, -140°C và -196° C. Nói chung mức nhiệt độ cao hơn -30° C cho hiệu quả thấp do tế bào chịu nồng độ muối cao sinh ra từ các chất điện giải. Phương pháp bảo quản này có hiệu quả với nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn, xạ khuẩn và virut.

Đặc biệt với phương pháp bảo quản lạnh sâu trong nitơ lỏng là phương pháp vạn năng hơn cả. Phương pháp này thích hợp với nhiều đối tượng vi sinh vật khác nhau như vi khuẩn, nấm sợi, nấm men, virut, tảo và cả các dòng tế bào động vật.

Tuy nhiên, phương pháp lạnh sâu cũng bộc lộ một số nhược điểm như đầu tư kinh phí cho thiết bị và điện, nitơ lỏng hoặc rủi ro như cháy nổ… Đặc biệt phương pháp này không thích hợp với các chủng vi sinh vật thường xuyên dùng đến. Nói chung phương pháp này thường được dùng với các chủng vi sinh vật có những đặc tính quí mà không thích hợp với phương pháp đông khô.

Tổng kết:

Chúng ta đã đi qua các phương pháp bảo quản chủng vi sinh vật phổ biến và hiệu quả nhất hiện nay.

Đối với đa số Viện và Trung tâm nghiên cứu, kỹ thuật cấy truyền và nuôi cấy vi sinh vật là phổ biến hơn cả.

Đối với các công ty và trung tâm kiểm nghiệm, do yêu cầu về tiêu chuẩn chất lượng cao của chủng giống vi sinh vật nên phương pháp đông khô và lạnh sâu thường được ưu tiên triển khai.

Mặc dù vậy, tùy thuộc vào nhu cầu và ngân sách cho phép mà mỗi đơn vị sẽ lựa chọn những phương pháp bảo quản vi sinh vật phù hợp để đảm bảo độ tinh sạch và đặc tính sinh học của từng chủng giống chuẩn.

Nguồn: Giáo trình Vi sinh vật – GS. Nguyễn Lân Dũng

Các phương pháp dùng cho bảo quản vi khuẩn và xạ khuẩn:

Bảo quản vi khuẩn:

Phương pháp đông khô (Freeze drying/ lyophilization):

Đây là phương pháp phổ biến được sử dụng tại mọi bảo tàng vi sinh vật trên thế giới. Phương pháp đông khô hạn chế được sự thay đổi các đặc tính của vi sinh vật và bảo quản được trong một thời gian dài.

Phương pháp đông khô được trình bày ở đây là phương pháp được dùng tại NCTC (National Colleciton Type Culture, Anh).

Nuôi vi khuẩn cho đông khô:

Vi khuẩn được cấy trên môi trường ống thạch nghiêng thích hợp. Tuy nhiên, cũng có thể chuẩn bị dịch vi khuẩn trên môi trường dịch thể nhưng phải làm đậm đặc tế bào bằng li tâm. Tuổi của tế bào cũng rất quan trọng do đó thường chọn tế bào nằm trong pha sinh trưởng log.

Chuẩn bị đệm mẫu:

Có thể dùng một trong hai loại đệm sau:

+ Đệm huyết thanh- inositol;

Meso-inositol: 5 gam

Huyết thanh ngựa (số 3): 100 ml

Thanh trùng bằng phương pháp lọc vi khuẩn, sau đó phân 5ml vào các bình vô trùng.

+ Đệm inositol:

Môi trường dinh dưỡng bột số 2: 2.5 gam

Meso-inositol: 5 gam

Nước cất: đủ 100 ml.

Phân 5 ml vào các bình và khử trùng tại nhiệt độ 121OC.

Chuẩn bị dịch tế bào:

Mật độ tế bào có ý nghĩa quan trọng đối với chất lượng bảo quản. Thông thường có thể thu sinh khối từ mỗi ống thạch nghiêng chỉ dùng cho 1-2 ml đệm pha mẫu để tạo dịch huyền phù tế bào. Mật độ vi khuẩn thông thường cần đạt 1010 (đối với vi sinh vật không có bào tử). Mật độ trên có thể giảm với các vi sinh vật có bào tử. Hai đệm pha mẫu trên có thể dùng với mọi vi khuẩn nhưng trong trường hợp enterobacteria thì không dùng đệm huyết thanh vì sẽ gây ra thay đổi đặc tính miễn dịch của vi khuẩn.

Chuẩn bị ống đông khô:

Ống đông khô được rửa sạch sau đó ngâm qua đệm với dịch acid loãng (HCl 2%) và lại được rửa sạch, làm khô và chuẩn bị nút bông, ống được thanh trùng khô hoặc khử trùng theo phương pháp thông thường.

Chuẩn bị mẫu trước khi đông khô:

Lượng dịch huyền phù vi khuẩn được đưa cẩn thận bằng pipet pasteur vào ống đông khô khoảng 0.1- 0.2 ml. Chú ý mọi thao tác phải cẩn thận tránh dính mẫu vào thành hay phía trên của ống đông khô.

Bước tiền đông khô:

Mục tiêu của bước này là làm bay hơi hết nước có thể bị lạnh đông tạo đá. Trước khi tiến hành đông khô mẫu được chuẩn bị qua bước tiền đông (như trình bày ở trên) sau đó bước tiền đông khô tiến hành khi mẫu được lắp vào hệ thống đông khô và quá trình làm mất nước trong điều kiện lạnh được tiến hành khoảng 3 giờ.

Tạo chỗ thắt trên ống đông khô:

Sau bước tiền đông khô, yêu cầu phải tạo vết thắt. Việc tạo vết thắt được thực hiện với hệ thống đèn hàn. Tuy nhiên, hiện nay các cơ sở bảo quản vi sinh vật sử dụng hệ thống hàn và tạo vết thắt trên thiết bị tự động.

Hậu đông khô:

Trong bước này mẫu lại tiếp tục được làm khô cho đến độ ẩm cuối cùng đạt khoảng 1%. Thời gian cho bước này có thể thay đổi từ 1-2 giờ.

Hàn ống đông khô:

Việc hàn ống trực tiếp trên thiết bị đông khô (manifold) cần có kinh nghiệm và cẩn thận. Trước hết phải tiến hành khoá van và sau đó mới thực hiện thao tác hàn ống đông khô.

Kiểm tra độ chân không của ống đông khô:

Người ta sử dụng thiết bị là đèn phát hiện mức độ chân không. Với các mẫu đạt độ chân không cần thiết thì xuất hiện màu xanh tím nhạt. Đối với các mẫu không đạt tiêu chuẩn thì không có tín hiệu hoặc màu tím đậm.

Kiểm tra khả năng sống của mẫu:

Đếm số lượng tế bào là phương pháp chủ yếu để đánh giá chất lượng bảo quản. Việc đếm được thực hiện trước khi và ngay sau khi đông khô. Các bước kiểm tra tiếp theo có thể được thực hiện sau 1 hoặc 5 năm để đánh giá chất lượng của mẫu đông khô. Nói chung khả năng sống của vi sinh vật có bào tử cao hơn vi sinh vật không có bào tử và loại gram dương cao hơn vi sinh vật gram âm. Tuy nhiên, với vi sinh vật kỵ khí thì yêu cầu phải được tiến hành theo đúng qui trình, tránh vi sinh vật tiếp xúc với oxy.

Bảo quản mẫu:

Mẫu thông thường được bảo quản tại 4OC hay nhiệt độ phòng.

b. Phương pháp giữ trong lạnh sâu:

1, Chuẩn bị tế bào cho lạnh sâu:

Tế bào được nuôi cấy trên môi trường và nhiệt độ thích hợp nhất tại giữa hoặc đầu pha log.

2, Pha dịch tế bào với glycerol hoặc DMSO đã thanh trùng trước để đạt nồng độ cuối cùng 10% và mật độ tế bào 106.

3, Dịch huyền phù tế bào được đưa vào ống lạnh sâu và đóng nắp (trong trường hợp hàn ống thuỷ tinh, cần để trong dịch xanh metylene 0.05% để phát hiện các ống bị rò rỉ).

Toàn bộ mẫu để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để cho cân bằng áp suất thẩm thấu trong và ngoài tế bào. Trong trường hợp có nitơ lỏng thì mẫu được chuyển sang bình nitơ lỏng.

Mẫu đưa vào lạnh sâu cũng cần theo tốc độ nhất định. Thông thường tốc độ lạnh dao động 1-3 OC/phút để đạt tới nhiệt độ -30OC ban đầu. Sau đó mẫu được làm lạnh tiếp với tốc độ cao hơn 10-15 OC/phút để đạt tới nhiệt độ lạnh cần thiết (-100OC đến -80 OC). Hiện nay, đã có các thiết bị làm lạnh sâu được chương trình hoá với tốc độ mong muốn. Tuy nhiên, cũng có thể đơn giản hơn là mẫu ban đầu được đặt trong đá khô sau đó lại đưa vào tủ lạnh sâu và đặt thời gian vài giờ để đạt nhiệt độ -65OC.

4, Hoạt hoá mẫu: mẫu trong lạnh (lạnh sâu hay nitơ lỏng) được hoạt hoá bằng cách làm tan nhanh tới mức có thể (thông thường đưa ngay vào tủ ấm 37 OC trong 40-60 giây). Như vậy, theo cách trên có thể đạt được khả năng sống 95% tế bào sau 10 năm bảo quản.

c. Một số phương pháp bảo quản khác:Bảo quản trên gelatin và silicagel.

Bảo quản xạ khuẩn:

Xạ khuẩn mang cả đặc tính của vi khuẩn và nấm sợi (có sợi và bào tử) do đó cần có những phương pháp bảo quản thích hợp.

Thông thường xạ khuẩn cũng được bảo quản theo các cách thông thường như cấy truyền, đông khô và lạnh sâu như với vi khuẩn ở trên. Tuy nhiên, có phương pháp kinh tế mà vẫn đảm bảo chất lượng chủng bảo quản mà chúng tôi trình bày ở đây, đó là phương pháp bảo quản trong đất.

Các bước tiến hành bảo quản trong đất:

1, Chuẩn bị đất: lấy đất vườn làm khô tại 150 OC trong 6 giờ để làm chết các vi sinh vật có bào tử và trứng giun nếu có. Đất sau khi thanh trùng được nghiền nhỏ qua lưới có kích thước 30 mesh. Đất sau khi nghiền được đưa vào ống nghiệm chuẩn bị nút bông và thanh trùng trong 60 phút. Trước khi tiến hành bảo quản phải kiểm tra nhiễm sự khuẩn trong đất bằng cách cấy vòng que cấy đất từ ống nghiệm đặt vào môi trường giàu dinh dưỡng cho vi khuẩn và giữ ở 24 OC, 28 OC và 37 OC, kiểm tra sau 2-4 ngày.

2, Chuẩn bị dịch huyền phù xạ khuẩn. Nước cất vô trùng được dùng để tạo dịch huyền phù xạ khuẩn (hay bào tử xạ khuẩn) từ ống thạch nghiêng. Lấy 1 ml dịch huyền phù cho vào mỗi ống nghiệm và để khô tại nhiệt độ phòng (24OC) trong thời gian 1 tháng. Đập nhẹ vào thành ống cho các hạt tách đều ra và bảo quản mẫu tại 4OC.

3, Hoạt hoá mẫu đơn giản bằng cách lấy vòng que cấy mẫu đưa lên môi trường (thạch hoặc dịch thể) và để ở nhiệt độ thích hợp.

kĩ thuật phân lập và bảo quản giống vi sinh vật thuần khiết nhóm 2
kĩ thuật phân lập và bảo quản giống vi sinh vật thuần khiết nhóm 2

Materials and Equipment

  • Bút ghi nhãn
  • Dịch vi khuẩn mới nuôi cấy (lỏng), nuôi qua đêm, khoảng từ 8-12 tiếng là tốt nhất cho bảo quản đông lạnh
  • Pipet 1 mL ; đầu típ đã thanh trùng
  • Tube ly tâm hoặc tube có nắp đậy
  • Glycerol đã thanh trùng
  • Nito lỏng (có thể có hoặc không)
  • Liquid nitrogen (optional)
  • Túi ni lông có thể khóa kín (Túi có đường viền gắn lại được dùng để để tube chứa vi khuẩn vào bên trong tránh không khí)
  • Tủ lạnh

Procedure

  1. Ghi nhãn vi khuẩn, ngày tháng
  2. Thêm 150 uL glycerol vào tube (pha loãng glycerol để đạt nồng độ cuối từ 5-15%, thông thường dùng 10% Glycerol bằng cách pha loãng 2 lần glycerol 20% trong dịch nuôi vi khuẩn)
  3. Dùng tip mới thêm 850 uL dịch nuôi tb vi khuẩn vào ống đó
  4. Đậy nắp và dốc xuôi ngược tube để trộn đều glycerol và vi khuẩn
  5. Nếu định bảo quản ở -80 độ thì trước hết phải SNAP-FREE vi khuẩn bằng cách cho vào nito lỏng. Nếu chỉ định bảo quản ở tủ lạnh (-20 độ) thì không cần xử lý gì thêm
  6. Chú ý: Không nên bảo quản mẫu vi khuẩn trong cùng tủ lạnh với thức ăn, nếu buộc phải vậy thì ta cho vào 2 lần túi bóng kín (resealable bags) để tránh nhiễm chéo

Chế phẩm là sản phẩm có chứa các vi sinh vật sống trong thành phần của chúng có khả năng mang lại lợi ích cho sự phát triển của các loài thực vật khác nhau. Chế phẩm vi sinh là một phần không thể thiếu của hệ thống cung cấp dinh dưỡng tích hợp vì chúng là nguồn dinh dưỡng thực vật có hiệu quả về chi phí để bổ sung phân bón hoá học cho các hoạt động nông nghiệp bền vững. Chế phẩm vi sinh giúp tăng năng suất cây trồng thông qua nhiều cơ chế như tăng cố định nitơ sinh học, tăng khả hấp thụ chất dinh dưỡng có sẵn của cây trồng thông qua quá trình hoà tan hoặc tăng khả năng hấp thụ, kích thích sự phát triển của thực vật thông qua hoạt động của hoocmon hoặc kháng sinh thực vật…

Vi khuẩn vùng rễ thúc đẩy phát triển thực vật (PGPR)

Cây chủ

Lợi ích đối với cây trồng

Nguồn tham khảo

Pseuomona sp. P34

Lúa mì

Sản xuất siderophore

Thúc đẩy sự phát triển của rễ và tích luỹ chất khô

[1]

Bradyrhizobium diazoefficiens

Đậu tương

Cố định đạm cộng sinh

[2]

Eneterobacter sp. PR14

Gạo và kê

Khả năng chống chịu “stress” mặn

[3]

Paenibacillus polymyxa Sx3

Cải dầu

Phân giải lân và sản xuất sinh khối

[4]

Azospirillum brasilense, Bacillus subtilis

Lúa mì

Khả năng chịu đựng stress hạn hán

[5]

Pantoea sp. S32

Gạo

Tăng khả năng hấp thu dinh dưỡng

[6]

Bacillus mojavensis JK07 và Rhodopseudomonas palustris

Cỏ ngô

Phân giải kali, tăng năng suất và sinh khối dưới điều kiện mặn

[7]

Bacillus sp.; Bacillus mojavensis

Cà chua; đậu tương

Sản xuất các hormon sinh trưởng

[8]

Burkholderia vietnamiensis

Lúa

Tăng năng suất

[9], [10]

Paenibacillus cineris TP-1.4

Rau muống

Tăng tỷ lệ nảy mầm của hạt, kích thích sinh trưởng, giảm 25% lượng phân đạm

[11]

Lợi ích của các vi khuẩn vùng rễ thúc đẩy sinh trưởng thực vật đến cây chủ

Việc sử dụng chế phẩm vi sinh thay vì phân khoáng và thuốc trừ sâu là xu hướng phát triển nông nghiệp toàn cầu vì sự phát triển bền vững của môi trường. Phân vi sinh có chứa vi khuẩn cố định đạm đã được chứng minh là nguồn rẻ nhất, đặc biệt là cây họ đậu. Đây là loại phân bón sinh học có lịch sử lâu đời nhất được sử dụng trong nông nghiệp. Vi khuẩn cố định nitơ và các vi sinh vật khác có khả năng chuyển đổi nitơ khí quyển thành các hợp chất mà thực vật có thể sử dụng được gọi là vi sinh vật cố định đạm (diazotrops), và quá trình này được gọi là quá trình cố định đạm. Các vi sinh vật cố định đạm có thể sống tự do trong đất hoặc cộng sinh với cây chủ. Vi khuẩn cố định đạm cộng sinh, gọi chung là rhizobia, có thể thiết lập công sinh với rễ cây họ đậu và có định nitơ trong khí quyển có lợi cho cây trồng. Bằng cách thiết lập mối quan hệ cộng sinh và thực hiện cố định đạm, rhizobia cải thiện hàm lượng nitơ và tăng năng suất cây trồng.

Hiện nay, đối tượng vi sinh vật cố định đạm sinh học có tầm quan trọng rất lớn vì việc sử dụng phân bón có chứa nitơ đã dẫn đến mức độ ô nhiễm nước không thể chấp nhận được (tăng nồng độ nitrat độc hai trong nguồn cung cấp nước uống) và làm phú dưỡng các hồ và sông. Hơn nữa, các vi sinh vật cố định đạm có thể được điều chỉnh cho phù hợp với nhu cầu sinh vật, còn phân bón thì thường bón với liều lượng lớn, có thể lên đến 50% trong đó bị rửa trôi. Điều này không chỉ gây lãng phí năng lượng và tiền bạc mà còn dẫn đến các vấn đề ô nhiễm nghiêm trọng, đặc biệt là nguồn cung cấp nước.

Kể từ khi bắt đầu sản xuất chế phẩm, ngành công nghiệp đã quan tâm đến việc tạo ra các sản phẩm ngày càng hiệu quả, với chi phí thấp, xử lý phù hợp với nhu cầu và yêu cầu chất lượng của nông dân. Một khía cạnh quan trọng là sự lựa chọn chất mang cho vi sinh vật, phải cung cấp khả năng tồn tại lâu dài của tế bào và dễ ứng dụng. Năm 1896, tại Hoa Kỳ, chế phẩm đầu tiên được sản xuất thương mại “Nitragin” sử dụng gelatin và sau đó, môi trường dinh dưỡng được sử dụng làm chất mang cho tế bào vi khuẩn. Do tỷ lệ tử vong cao, những chất mang này sớm được thay thế bằng than bùn, vẫn được coi là chất mang “vàng” cho đến cuối những năm 1990. Than bùn là một vật liệu rắn, bao gồm đất hữu cơ xuất hiện trong một số một trường đặc biệt và được hình thành sau một thời kỳ địa chất lâu dài. Than bùn là chất mang được sử dụng rộng rãi nhất do các đặc tính tốt như giàu chất hữu cơ, cung cấp sự bảo vệ vật lý cho vi sinh vật chống lại các tác nhân gây hại của đất và cho phép tế bào tồn tại tốt hơn trong điều kiện hạn chế nước và nhiệt độ cao do đó nó hỗ trợ thành công sự phát triển và tồn tại của rhizobia. Than bùn có thể duy trì số lượng rhizobia cao trong thời gian bảo quản ở nhiệt độ lên đế 28oC. Tuy nhiên, các vấn đề với việc sử dụng than bùn bao gồm chi phí khử trùng cao, quá trình chế biến phức tạp (sấy khô, xay xát) , khó ứng dụng trên quy mô lớn, cũng như không thể tiếp cạn được các bãi thải than bùn. Ngoài ra, việc khai thác bãi than bùn, có thể gây ra những tác động nghiêm trọng đến môi trường, bao gồm cả việc phá huỷ môi trường sống và phát thải CO2. Những vẫn đề này đã kích thích sự phát triển và ứng dụng của các công thức chế phẩm dạng lỏng để giải quyết các vấn đề liên quan đến việc ứng dụng và xử lý chế phẩm dạng rắn.

Ưu điểm chính của chế phẩm này so với chế phẩm rắn, các công thức dạng lỏng cho phép nhà sản xuất bao gồm cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng, chất bảo vệ tế bào và chất cảm ứng chịu trách nhiệm hình thành tế bào/bào tử/nang để cải thiện hiệu suất. Trong khi thời hạn sử dụng của chế phẩm dựa trên chất mang rắn thông thường là khoảng 6 tháng (hoặc trong trường hợp tốt nhất là 12-18 tháng), một lợi thế khác của chế phẩm dạng lỏng là thời gạn sử dụng có thể lên đến 2 năm. Chúng có một số nhược điểm lớn là bảo quản dài lâu cần điều kiện mát hoặc lạnh, hạn sử dụng trong một số trường hợp là ngắn, tăng chi phí. Chế phẩm trở nên phổ biến ở các nước phát triển để cấy vào cây họ đậu vì số lượng tế bào cao. Chế phẩm lỏng có chứa nồng độ 2×109 tế bào/ml hiện nay đã trở nên phổ biến, cho phép tỷ lệ áp dụng thấp hơn và tăng hiệu quả sử dụng chế phẩm [9]. Hơn nữa, người ta khẳng định rằng những chế phẩm này không bị nhiễm bẩn và có thời hạn sử dụng lâu hơn đối với một số công thức, khả năng bảo vệ tố hơn chống lại các áp lực môi trường và tăng hiệu quả thực địa, so với chế phẩm dựa trên than bùn. Chúng thuận lợi cho các nhà sản xuất chế phẩm quy mô nhỏ ở vùng nhiệt đới thiếu khả năng xử lý than bùn như một chất mang.

Brahmaprakash et al. (2007) [10] tìm thấy rằng số nốt sần của cây và năng suất hạt sau khi cấy với chế phẩm Rhizobium lỏng được cải thiện hơn khi so sánh sang chế phẩm Rhizobium dựa trên chất mang rắn trong cây lạc. Til KC et al. (2019) [11] đã xác định chủng Bradyrhizoium japonicum có khả năng chịu đựng tốt trong môi trường pH axit, nồng độ muối NaCl 1% và 2% và tạo sinh khối tốt nhất trong điều kiện natri alginat bổ sung sucrose. Rabia Khalid et al. (2020) [12] đã nghiên cứu chủng Rhizobium sp. Có thể chịu được nồng độ muối NaCl lên đến 3% và phát triển ở dãy nhiệt độ rộng từ 20 đến 37oC với pH từ 5-10.

Sự phát triển môi trường nuôi cấy cải tiến và chất mang tăng cường khả năng sống sót của chế phẩm vi khuẩn là vấn đề quan trọng để đảm bảo duy trì chất lượng chế phẩm trong quá trình bảo quản và vận chuyển ra hiện trường [13].

Các công thức chế phẩm dạng lỏng có thể bao gồm một hoặc nhiều chủng rhizobia với tác nhân mà nó thúc đẩy sự tồn tại của tế bào trong các sản phẩm thương mại trong quá trình bảo quản và sau khi bón và hạt giống hoặc đất. Ví dụ, ở Brazil, sự kết hợp của hai dòng Bradyrhizobium cho cây đậu tương đã được nông dân ưu tiên sử dụng từ những năm 1950 [12], [13]. Việc tẩm vi khuẩn nốt sần Rhizobia và hạt có thể xảy ra trước khi gieo hoặc trước khi bán hạt giống. Do đó, nhà bán hàng cần phải cung cấp khả năng tồn tại kéo dài của vi khuẩn nốt sần trên hạt giống trước khi được cấy giống. Đây là một kỹ thuật nhẹ nhàng và hoạt động trong điều kiện môi trường xung quanh đảm bảo tổn thương tế bào được giảm thiểu đến mức tối thiều. Hạt giống được cấy sẵn, được chuẩn bị trước vài ngày hoặc vài tháng trước khi gieo, nên có các đặc tính tương tự nhay hạt được xử lý trước khi gieo. Ứng dụng hạt giống được cấy sẵn góp phần đơn giản hoá quá trình gieo hạt cho nông dân trên cánh đồng.

Về cơ bản, chế phẩm dạng lỏng là chất nuôi cấy hoặc huyền phù vi sinh vật, chủ yếu trong nước, nhưng cũng có trong dầu khoáng hoặc dầu hữu cơ, được bổ sung bằng các chất khác. Vai trò của các chất phụ gia được áp dụng là cải thiện chất lượng chế phẩm, chẳng hạn như tăng độ dính, độ ổn định, và khả năng phân tán và chất hoạt động về mặt, cũng như cung cấp một phương pháp bảo vệ cho vi sinh vật và đảm bảo khả năng tồn tại trong thời gian dài bảo quản. Các chất bố sung được áp dụng cũng nên mang lại sự sống sót của tế bào vi khuẩn nốt sần trên hạt giống.

Một chất phụ gia phổ biến là sucrose, giúp cải thiện tỷ lệ sống, chủ yếu vi khuẩn nốt sần, nhưng cũng cho vi khuẩn phân giải lân phát triển. Điều này đã cải thiện hiệu suất phân giải lân đối với cây đậu phộng ( [14]). Việc bổ sung glycerol vào môi trường nuôi cấy bảo tồn khả năng tồn tại của tế bào Pseudomonas fluorescens ở dạng lỏng để bảo quản kéo dài 6 tháng. Glycerol được sử dụng như một chất bổ sung vì nó giữ một lượng nước đáng kể và bảo vệ tế bào khỏi bị khô bằng cách làm chậm tốc độ khô (Manikandan et al. 2010). Hầu hết các chất phụ gia có bản chất là cao phân tử, với trọng lượng phân tử cao. Chúng bao gồm carboxymethyl cellulose (CMC), gum arabic, and polyvinylpyrrolidone (PVP). Aneta VB et al 2018 đã áp dụng mười công thức môi trường khác nhau của chế phẩm vi sinh (canh men mannitol với việc bổ sung thạch, natri-alginat, canxi clorua, glycerol hoặc clorua sắt và sự kết hợp của chúng) để tìm sự tồn tại của rhizobium cố định đạm hiệu quả, Sinorhizobium (Ensifer) meliloti chủng L3Si. Chế phẩm lỏng thích hợp nhất để tồn tại L3Si trong thời gian bảo quản 150 ngày là chế phẩm môi trường có chứa glycerol kết hợp với thạch hoặc natri-alginat.

Chất phụ gia

Chủng vi sinh vật sử dụng

Thực vật

Nguồn tham khảo

Carboxymethyl

Acinetobacter calcoaceticus,

Dầu mè

[15]

Glycerol

Bradyrhizobium japonicum

Đậu nành

[16]

Bacterial exopolysaccharides

Bradyrhizobium

Đậu nành và đậu đũa

[17]

PVP, Na-alginate

Bradyrhizobium japonicum

Đậu nành

[18]

Gum Arabic

Bradyrhizobium sp.;

Keo tai tượng, đậu xanh, keo, gạo

[19]; [20]; [21]

Các nghiên cứu về chất phụ gia bổ sung trong chế phẩm vi sinh dạng lỏng

Cho đến nay, các tài liệu đã cung cấp bằng chứng mạnh mẽ rằng các vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật giúp tăng cường sự phát triển và năng suất của cây trồng thông qua nhiều cơ chế và quy trình khác nhau. Thách thực đối với cộng đồng khoa học và ngành công nghiệp phân bón là phát triển các công cụ và công nghệ như thế nào để tạo điều kiện thuận lợi cho nông dân sử dụng hiệu quả các vi sinh vật này. Các công thức hiệu quả của PGPR có thể cải thiện độ phì nhiêu của đất, khả năng chống chịu của cây trồng, năng suất cây trồng và duy trì chu kỳ dinh dưỡng trong các hệ thống nông nghiệp. Các nhà nghiên cứu cần tăng cường việc phân lập các chủng mới cũng như cần khuyến khích phát triển các công thức đa dạng chủng vi sinh vật nhằm khám phá và bảo đảm nguồn gen của đất, từ đó tăng cường các hệ sinh thái trên cạn mà từ đó có thể phân lập vi khuẩn có ích. Hơn nữa, các nghiên cứu về tác động của chế phẩm vi sinh đối với các tổ chức vi sinh vật có ích cần được tiến hành để đảm bảo tính bền vững và tránh những thay đổi không thể đảo ngược đối với đa dạng sinh học đất. Bên cạnh những nổ lực trong nghiên cứu các công cụ chính sách, kế hoạch phát triển nông thôn, cần thúc đẩy nhận thức của người nông dân về những lợi ích tiềm năng của việc sử dụng vi sinh vật thúc đẩy tăng trưởng thực vật. Cuối cùng, cần có sáng kiến thúc đẩy và nêu bật tầm quan trọng của các cộng đồng vi sinh vật kết hợp với giống cây trồng thích hợp để thích ứng và giảm thiểu biến đổi khí hậu trong các kế hoạch hành động.

Tài liệu tham khảo

[1]

Liu X, Jiang X, He X, Zhao W, Cao Y, Guo T, Li T, Ni H, Tang X, “Phosphate-solubilizing Pseudomonas sp. strain P34-L promotes wheat growth by colonizing the wheat rhizosphere and improving the wheat root.,” J Plant Growth Regul, vol. 38, no. 4, p. 1314–1324, 2019.

[2]

López MF, Hegel VA, Torres MJ, García AH, Delgado MJ, López-García SL, “The Bradyrhizobium diazoefficiens two-component system NtrYX has a key role in symbiotic nitrogen fixation of soybean plants and cbb 3 oxidase expression in bacteroids.,” Plant Soil, vol. 440, no. 1-2, p. 167–183, 2019.

[3]

Sagar A, Sayyed RZ, Ramteke PW, Sharm S, Marraiki N, Elgorban AM, Syed A, “ACC deaminase and antioxidant enzymes producing halophilic Enterobacter sp. PR14 promotes the growth of rice and millets under salinity stress.,” Physiol Mol Biol Plants, vol. 26, no. 9, p. 1847–1854, 2020.

[4]

Zheng BX, Ding K, Yang XR, Wadaan MA, Hozzein WN, Peñuelas J, Zhu YG, “Straw biochar increases the abundance of inorganic phosphate solubilizing bacterial community for better rape (Brassica napus) growth and phosphate uptake.,” Sci Total Environ, vol. 647, p. 1113–1120, 2019.

[5]

Ilyas N, Mumtaz K, Akhtar N, Yasmin H, Sayyed RZ, Khan W, El Enshasy HA, Dailin DJ, Elsayed EA, Ali Z, “Exopolysaccharides producing bacteria for the amelioration of drought stress in wheat.,” Sustainability, vol. 12, no. 21, p. 8876, 2020.

[6]

Chen Q, Liu S, “Identification and characterization of the phosphate-solubilizing bacterium Pantoea sp. S32 in reclamation soil in Shanxi, China.,” Front. Microbiol, vol. 10, p. 2171, 2019.

[7]

Feng K, Cai Z, Ding T, Yan H, Liu X, Zhang Z , “Effects of potassium-solubulizing and photosynthetic bacteria on tolerance to salt stress in maize.,” J Appl Microbiol, vol. 126, no. 5, p. 1530–1540, 2019.

[8]

Kalam S, Basu A, Podile AR, “Functional and molecular characterization of plant growth promoting Bacillus isolates from tomato rhizosphere.,” Heliyon, vol. 6, no. 8, p. e04734, 2020.

[9]

V. Trân Van, O. Berge, S. Ngô Kê, J. Balandreau & T. Heulin , “Repeated beneficial effects of rice inoculation with a strain of Burkholderia vietnamiensison early and late yield components in low fertility sulphate acid soils of Vietnam,” Plant and Soil, vol. 218, p. 273–284, 2000.

[10]

N. T. Phong, “ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA CHẾ PHẨM ĐẠM SINH HỌC Burkholderia vietnamiensis,” Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, vol. 54, no. 6A, pp. 29-34, 2018.

[11]

Lê Thị Xã, Đỗ Thành Luân, Nguyễn Khởi Nghĩa, “Khảo sát khả năng kích thích nảy mầm và sinh trưởng rau muống của một số dòng vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA,” Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, vol. 56, pp. 37-46, 2020.

[12]

Shulz TJ, Thelen KD, “Soybean seed inoculant and fungicidal seed treatment effects on soybean.,” Crop Sci, vol. 48, no. 5, p. 1975–1983, 2008.

[13]

Brahmaprakash GP, Girisha HC, Navi V, Laxmipathy R, Hegde SV, “Liquid Rhizobium inoculant formulations to enhance biological nitrogen fixation in food legumes.,” J. Food Legumes, vol. 20, no. 1, p. 75–79, 2007.

[14]

Til KC, Bijay RS, Bijaya P, “Isolation, Identification and Production of Encapsulated Bradyrhizobium japonicum and Study on their Viability,” Nepal Journal of Biotechnology, vol. 7, no. 1, pp. 39-49, 2019.

[15]

Rabia K, Xiao XZ, Rifat H, Mukhtar A, “Molecular Characteristics of Rhizobia Isolated from Arachis Hypogaea Grown under Stress Environment,” Sustainability, vol. 12, p. 6259, 2020.

[16]

Bashan Y, de-Bashan LE, Prabhu SR, Hernandez JP, “Advances in plant growth-promoting bacterial inoculant technology: formulations and practical perspectives (1998–2013).,” Plant Soil, vol. 378, no. 1-2, pp. 1-33, 2014.

[17]

Hungria M, Vargas MAT, Campo RJ và Galerani PR 1997b Adubação nitrogenada em soja? Embrapa CNPSo Com. Técnico 57, Embrapa Soja, Londrina-PR. 4 p., “Fixação biológica do nitrogênio na cultura da soja,” Embrapa CNPSo Com, vol. 57, pp. 1-4, 1997.

[18]

Hungria M, Mendes IC, Nitrogen Fixation with Soybean: The Perfect Symbiosis?, vol. 2, John Wiley & Sons, Inc., 2015, pp. 1009-1023.

[19]

Taurian T, Anzuay MS, Angelini JG, Tonelli ML, Ludueña L, Pena D,Ibáñez F, Fabra A, “Phosphate-solubilizing peanut associatedbacteria: screening for plant growth-promoting activities,” Plant Soil, vol. 329, p. 421–431, 2010.

[20]

Jha CK, Saraf M, “Evaluation of multispecies plant-growthpromoting consortia for the growth promotion of Jatrophacurcas L.,” J Plant Growth Regul , vol. 31, p. 588–598, 2012.

[21]

Auges G, Barend JV, Mireille AM, Edgar M, Robert M, Ahmed IH, “Efficacy of Peat and Liquid Inoculant Formulations ofBradyrhizobium japonicum Strain WB74 on Growth, Yield andNitrogen Concentration of Soybean (Glycine max L.),” Nitrogen, vol. 2, p. 332–346, 2021.

[22]

Thiago PF, Bruno LS, Cláudio SBD, Fatima MDSM, “Polymeric formulations of liquid inoculants with rhizobia exopolysaccharides increase the survival and symbiotic efficiency of elite Bradyrhizobium strains,” Archives of Microbiology, vol. 204, no. 3, p. 177, 2022.

[23]

Pulak M, Jubair A, Dipa M, Md. SA, “Polyvinylpyrrolidone (PVP) and Na-Alginate AdditionEnhances the Survival and Agronomic Performances of aLiquid Inoculant of Bradyrhizobium japonicum for Soybean(Glycine max (L.) Merr.),” Agronomy, vol. 11, no. 5, p. 1009, 2021.

[24]

Diouf D, Forestier S, Neyra M, Lesueur D, “Optimisation of inoculation of Leucaena leucocephala and Acacia mangium with rhizobium under greenhouse conditions.,” Ann For Sci, vol. 60, p. 379–384, 2003.

[25]

Gamal-Eldin H, Elbanna K, “Field evidence for the potential of Rhodobacter capsulatus as biofertilizer for flooded rice.,” Curr Microbiol, vol. 62, p. 391–395, 2011.

[26]

Wani PA, Khan MS, Zaidi A, “Effect of metal tolerant plant growth promoting Bradyrhizobium sp. (vigna) on growth, symbiosis, seed yield and metal uptake by greengram plants.,” Chemosphere, vol. 70, p. 36–45, 2007.

[27]

Prajakta BM, Suvarna PP, Raghvendra SP, Alok RR, “Potential biocontrol and superlative plant growth promoting activity of indigenous Bacillus mojavensis PB-35 (R11) of soybean soybean (Glycine max) rhizosphere.,” SN Appl Sci, vol. 1, p. 1143, 2019.

[28]

Aneta VB, Olivera SS, Magdalena MK, Đorđe ŽK, Nataša VR, Dušica ID, “Development of liquid rhizobial inoculants and pre-inoculation of alfalfa seeds,” Arch Biol Sci, vol. 71, no. 2, pp. 379-87, 2019.

Credits given to Parafilm®

OSAMAHIEP

Nguồn gen vi sinh vật (VSV) có vai trò quan trọng trong chiến lược phát triển công nghệ sinh học. Hiện nay, Viện Bảo vệ thực vật đang bảo tồn và lưu giữ 915 nguồn vi sinh vật trong bảo vệ thực vật bao gồm 831 nguồn gen vi sinh vật gây bệnh thực vật (792 nguồn nấm sợi, 39 nguồn vi khuẩn) và 84 nguồn gen vi sinh vật có ích (53 nấm sợi, 3 nguồn nấm men, 23 nguồn vi khuẩn và 5 nguồn virút) phục vụ cho công tác nghiên cứu và sản xuất. Các phương pháp bảo quản đối với nguồn vi sinh vật gây bệnh gồm bảo quản trên giấy làm khô trong chân không (739 nguồn nấm), dầu khoáng (13 nguồn nấm), nước cất (19 nguồn nấm), glycerol (47 nguồn vi khuẩn).

Các phương pháp bảo quản nguồn vi sinh vật có ích gồm bảo quản trong glycerol (31 nguồn nấm), bảo quản trong glycerin (41 nguồn nấm và vi khuẩn), bảo quản lạnh và -20oC (5 nguồn vi khuẩn và vi rút). Trong năm 2020, nhiệm vụ tiếp tục bảo quản, lưu giữ lâu các nguồn gen đảm bảo duy trì sức sống của các nguồn vi sinh vật. Trong các nguồn gen vi sinh vật đang được lưu giữ và bảo quản, đã đánh giá ban đầu 362 nguồn gen, đánh gia chi tiết 195 nguồn gen, đánh giá đặc điểm di truyền 101 nguồn gen. So với tổng số nguồn gen đang được lưu giữ, công tác đánh giá ban đầu chiếm 39,56%, đánh giá chi tiết chiếm 21,31% và đánh giá các đặc điểm di truyền chiếm 11,38%. Do vậy công tác đánh giá ban đầu và đánh giá chi tiết cần được ưu tiên hơn. Vì thế, năm 2020, nhóm nghiên cứu của ThS. Mai Văn Quân tại Viện Bảo vệ thực vật đã thực hiện đề tài: “Bảo tồn, lưu giữ các vi sinh vật bảo vệ thực vật”.

Đề tài hướng đến thực hiện mục tiêu bảo tồn và lưu giữ, góp phần sử dụng hiệu quả, bền vững nguồn gen vi sinh vật bảo vệ thực vật phát triển nông nghiệp.

Đề tài đã thu được các kết quả nổi bật như sau:

– Đã bảo quản lâu dài 915 nguồn gen vi sinh vật bằng phương pháp đông khô, bào tử nấm, thể vùi. Cụ thể: đối với nguồn VSV gây bệnh: 792 nguồn bảo quản bằng phương pháp bào tử, 39 nguồn bảo quản đông khô; và đối với nguồn gen VSV có ích: 26 nguồn bảo quản bằng phương pháp đông khô, 53 chủng bảo quản bằng bào tử, 5 nguồn bảo quản bằng thể vùi.

– Đã phân loại đến loài 71 nguồn gen vi sinh vật bằng giải trình tự gen ITS/16S/28S.

– Đã đánh giá ban đầu 553 nguồn VSV bao gồm các đặc điểm hình thái, điều kiện sinh trưởng, hoạt tính sinh học.

– Đã rà soát và đề xuất loại bỏ 120 nguồn gen trong tổng số 915 nguồn gen ra khỏi danh mục bảo tồn và lưu giữ.

– Đã tư liệu hóa và cập nhật bổ sung thông tin cơ sở dữ liệu của 553 nguồn gen bao gồm các thông tin như tên nguồn gen, mã số, địa điểm thu thập, môi trường nuôi cấy, PP bảo quản, đặc điểm gây bệnh, đặc điểm sinh học…

– Đã cung cấp 07 nguồn gen VSV để đánh giá hiệu quả của chế phẩm thảo mộc và đánh giá giống chống chịu bệnh đạo ôn và khô vằn trên lúa và ngô.

Nhóm nghiên cứu cũng đề nghị loại bỏ các nguồn gen không có ý nghĩa trong ứng dụng nghiên cứu và các nguồn gen thu thập tương đồng về thời gian và địa điểm thu thập và tiếp tục bảo tồn và lưu giữ các nguồn gen vi sinh vật bảo vệ thực vật có ý nghĩa trong sản xuất.

Có thể tìm đọc báo cáo kết quả nghiên cứu (mã số 18783/2021) tại Cục Thông tin khoa học và công nghệ quốc gia.

Nguồn Vista.

Tin bài khác

Một số phương pháp phổ biến sử dụng trong bảo quản các nhóm vi sinh vật cụ thể

Science and Technology

Một số phương pháp phổ biến sử dụng trong bảo quản các nhóm vi sinh vật cụ thể:

Trong phần này chúng tôi giới thiệu cụ thể một số phương pháp thông dụng nhất.

Quy trình bảo quản và nhân giống các chủng vi sinh của MRBIO
Quy trình bảo quản và nhân giống các chủng vi sinh của MRBIO

Kỹ thuật bảo quản chủng vi sinh vật

Bảo quản chủng vi sinh vật có tầm quan trọng đặc biệt, làm nền tảng cho các nghiên cứu cơ bản và ứng dụng liên quan đến nhiều lĩnh vực: sinh học, y học, nông nghiệp và môi trường.

Nhiệm vụ quan trọng nhất của Bộ sưu tập chủng vi sinh vật là thu thập, làm giàu các chủng giống vi sinh vật hữu ích và bảo quản chúng theo phương pháp thích hợp. Việc thu thập các chủng vi sinh vật có thể bằng nhiều cách như phân lập, tuyển chọn từ môi trường, trao đổi trong nước và quốc tế. Các chủng vi sinh vật chuẩn phải được định hướng theo từng mục tiêu cụ thể của từng Bộ sưu tập, ví dụ các chủng vi sinh vật chuẩn, các chủng có hoạt tính sinh học và các chủng làm cơ sở cho tra cứu khi nghiên cứu tính đa dạng của vi sinh vật.

Bảo quản chủng vi sinh vật là công việc không dễ dàng, xuất phát từ mục đích của bảo quản không những là duy trì khả năng sống của vi sinh vật, thuần chủng, tránh tạp nhiễm mà còn đảm bảo tính ổn định di truyền và các đặc tính sinh học trong suốt quá trình bảo quản. Thực tế không có một phương pháp bảo quản nào là vạn năng dùng chung cho các nhóm chủng giống vi sinh vật mà mỗi nhóm vi sinh vật chỉ thích hợp với một vài phương pháp bảo quản nhất định.

Các chủng giống vi sinh vật bảo quản sẽ được cung cấp cho người sử dụng do đó nhiệm vụ quan trọng của bộ sưu tập vi sinh vật là thu thập và cung cấp các thông tin quan trọng của chủng vi sinh vật bảo quản cho người sử dụng như: môi trường nuôi cấy, nhiệt độ, nhu cầu dinh dưỡng, tính an toàn sinh học, tên phân loại v.v..Như vậy yêu cầu đối với cán bộ phụ trách Bộ sưu tập vi sinh vật phải có kiến thức vững về vi sinh vật, di truyền học, sinh hoá học, sinh lý vi sinh vật và bệnh học vi sinh vật để kiểm soát được các đặc tính quan trọng của các vi sinh vật bảo quản.

Một số điểm lưu ý đối với một Bộ sưu tập chủng vi sinh vật:

  • Duy trì khả năng sống của vi sinh vật bảo quản
  • Quan tâm đến số lượng tế bào khi tiến hành bảo quản
  • Duy trì đặc tính di truyền ổn định của chủng vi sinh vật bảo quản
  • Tính thuần chủng của vi sinh vật bảo quản
  • Cung cấp các thông tin liên quan đến chủng bảo quản
  • Kiểm tra chất lượng chủng vi sinh vật bảo quản

Phương pháp bảo quản nấm men:

Tương tự như nấm sợi, có nhiều phương pháp bảo quản nấm men. Chúng tôi chỉ đề cập đến các phương pháp thông dụng nhất đang được sử dụng tại các bộ sưu tập nấm men lớn trên thế giới.

a. Phương pháp cấy truyền:

Cấy truyền là phương pháp đơn giản, nhanh và rẻ tiền cũng như thông dụng nhất, tuy nhiên những hạn chế của phương pháp này là dễ tạp nhiễm cũng như những thay đổi các đặc điểm sinh học, tính trạng di truyền sẽ là bất lợi khi bảo quản theo phương pháp này.

Cấy truyền trên môi trường dịch thể:

– Cách tiến hành rất đơn giản là chuẩn bị 10 ml môi trường nuôi cấy nấm men (thông thường là môi trường YM Yeast extract – Maltose) trong lọ McCartney khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong 15 phút. Thường làm 2 lọ cho mỗi chủng bảo quản.

– Một vòng que cấy chủng nấm men bảo quản được đưa vào môi trường bằng thao tác vô trùng và giữ ở 25oC trong 72 giờ. Phải kiểm tra sự phát triển của chủng bảo quản.

– Sau đó các mẫu được giữ ở 4oC.

– Thông thường theo cách này thời gian bảo quản các chủng thường thay đổi từ 2- 6 tháng.

Cấy truyền trên môi trường thạch:

Cấy truyền trên môi trường thạch tương tự như môi trường dịch thể nhưng ở đây môi trường được bổ sung thạch (1.6%). Giống sau khi cấy được giữ trong 72 giờ ở nhiệt độ thích hợp để đạt độ phát triển cần thiết, sau đó được để ở 4-8oC. Theo phương pháp này giống có thời gian sống lâu hơn phương pháp cấy truyền dịch thể, thông thường giống được bảo quản từ 3-6 tháng.

Thời gian bảo quản có thể được kéo dài từ 2-3 năm nếu như các ống giống được bảo quản trong dầu parafil đã thanh trùng và được đổ lên trên môi trường thạch sao cho tạo một lớp dày khoảng 1cm.

b. Phương pháp bảo quản trong lạnh sâu và đông khô (xem phần các phương pháp dùng cho bảo quản vi khuẩn và xạ khuẩn).

Bảo quản các chủng vi sinh vật, để sản xuất các sản phẩm của MRBIO
Bảo quản các chủng vi sinh vật, để sản xuất các sản phẩm của MRBIO

Các phương pháp dùng cho bảo quản nấm sợi:

a. Phương pháp cấy truyền:

Phương pháp này thường được ứng dụng với các sợi nấm có bào tử. Các chủng nấm sợi được nuôi trên môi trường thạch thích hợp và để cho sợi nấm phát triển đến mức độ cực đại, sau đó là quá trình hình thành bào tử, các ống giống này sẽ được bảo quản theo các cách khác nhau:

– Các ống thạch được để trong tủ lạnh (4-7 OC).

– Bảo quản trong thạch dưới lớp dầu: Các ống thạch được bảo quản dưới lớp dầu parafin có tỷ trọng tương đối là 0.83- 0.89 đã được khử trùng ở nhiệt độ 121 OC trong 15 phút. Lớp dầu cách bề mặt thạch khoảng 1 cm. Nhiệt độ bảo quản là 15-20 OC.

– Bảo quản trong nước, nấm sợi được nuôi trên môi trường thạch đĩa. Sau khi sợi phát triển cực đại thì cắt thành từng miếng nhỏ kích thước khoảng 6 mm2 và cho vào lọ nước đã thanh trùng. Bảo quản tại nhiệt độ phòng.

b. Bảo quản nấm sợi có bào tử trong silicagel:

Chuẩn bị:

1, Lọ đựng silicagel (10-15ml) có nắp chịu nhiệt (sắt hay nhựa) thanh trùng ở nhiệt độ 170 OC trong 3 giờ.

2, Silicagel: Loại trong suốt, không có màu, kích thước và số lượng hạt silicagel đưa vào không quá 1/3 thể tích của lọ, thanh trùng ở nhiệt độ 170 °C trong 3 giờ.

3, Môi trường sữa tách bơ (Skimmilk) 20% khử trùng ướt (115OC/20 phút).

4, Ống thạch nghiêng (có thể đĩa petri) chứa bào tử nấm sợi, tuỳ theo từng chủng, môi trường nuôi cấy mà thời gian thu bào tử thích hợp khác nhau (10-15 ngày).

Cách tiến hành:

1, Dùng pipet pasteur lấy khoảng 3-4 ml sữa thanh trùng cho vào ống nghiệm chứa bào tử nấm sợi, dùng que cấy tạo dịch huyền phù bào tử có mật độ cao nhất (đối với một số chủng có số lượng bào tử thấp thì có thể tạo dịch bào tử từ một vài ống thạch bào tử khác nhau).

2, Dùng pipet pasteur lấy dịch bào tử cho vào lọ đựng silicagel. Chú ý silicagel hút nước và sinh nhiệt do đó việc đưa dịch bào tử vào phải được thực hiện trong chậu nước đá. Lượng dịch bào tử đưa vào không vượt quá 1/3 thể tích hạt silicagel trong lọ. Sau đó dùng tay lắc đều đảm bảo các hạt silicagel đều dính dịch bào tử nấm sợi. Dán nhãn, ghi các thông tin cần thiết như số mã chủng, ngày bảo quản, môi trường và nhiệt độ thích hợp…

3, Lọ silicagel được đậy nắp cẩn thận nhưng không vặn chặt (nới 1,5 vòng) sau đó giữ trong bình hút ẩm (độ ẩm 35-40%), 25OC trong 1 tuần. Vặn chặt nút và quấn giấy parafil giữ trong 4OC.

Kiểm tra độ sống sót sau khi bảo quản:

Mẫu silicagel ở 4 °C, dùng que cấy vô trùng lấy ra 3 hạt silicagel để trên mặt thạch môi trường mầm thóc (Maltagar), lắc đều cho hạt silicagel tiếp xúc lên mặt môi trường. Để ở nhiệt độ thích hợp, kiểm tra tra khuẩn lạc nấm theo thời gian thích hợp.

c. Bảo quản nấm sợi có bào tử theo phương pháp đông khô (freez-drying):

Chuẩn bị:

1, Ống đông khô rửa sạch (sonic cleaner) trong 15 phút sau đó khử trùng 170OC trong 3 giờ.

2, Môi trường sữa tách bơ (Skimmilk) 20% khử trùng ướt (115OC/20 phút).

3, Ống thạch nghiêng (có thể đĩa petri) chứa bào tử nấm sợi, tuỳ theo từng chủng môi trường nuôi cấy mà thời gian thu bào tử thích hợp khác nhau (10-15 ngày).

Cách tiến hành:

1, Dùng pipet pasteur lấy khoảng 3-4 ml sữa thanh trùng cho vào ống nghiệm chứa bào tử nấm sợi, dùng que cấy tạo dịch huyền phù bào tử có mật độ cao nhất (đối với một số chủng có số lượng bào tử thấp thì có thể tạo dịch bào tử từ một vài ống thạch bào tử khác nhau).

2, Dùng pipet pasteur lấy dịch bào tử cho vào ống đông khô (0,2 – 0,3 ml), thông thường chuẩn bị 13 ống cho mỗi chủng. Dán nhãn, ghi các thông tin cần thiết như mã số chủng, ngày bảo quản, môi trường và nhiệt độ thích hợp. Sau đó đậy bằng nút bông hay giấy bạc.

3, Giữ ở -80°C trong 3 giờ trước khi tiến hành đông khô, đồng thời bật máy Dura-Stop, khi nhiệt độ đạt -40OC, đưa mẫu vào tủ đông khô của Dura-Stop, bật máy Dura-Dry, khi mức độ chân không đạt 45 minitor, nhiệt độ -55OC, tăng nhiệt độ Dura-Stop lên -5OC, để qua đêm.

4, Tăng nhiệt độ Dura-Stop lên 25°C, khi đạt nhiệt độ cần thiết, tắt máy hút chân không nhưng không tắt Dura-Dry.

5, Tắt Dura-Stop, lần lượt nối tube mẫu vào hệ thống manifold, bật máy Dura-Dry, tiến hành hàn ống khi độ chân không đạt 45-48 minitor, nhiệt độ -55OC.

Chú ý: Trong trường hợp chỉ dùng Dura-Dry có thể được thực hiện như sau:

– Tiến hành các bước 1,2,3,4 như trên.

– Mẫu được để tiền đông khô ở -80°C trong 3 giờ. Bật máy Dura-Dry, khi đạt nhiệt độ -60oC đến -55oC, độ chân không 45 minitor, gắn ống mẫu với hệ thống manifold tiến hành hàn ống khi độ chân không đạt 45-48 minitor, nhiệt độ -55oC.

Kiểm tra độ sống sót sau khi đông khô:

1, Mở ống đông khô bằng cách đốt nóng đầu hàn trên đèn cồn và làm lạnh đột ngột bằng cồn đốt.

2, Dùng pipet pasteur lấy khoảng 1ml nước cất vô trùng từ ống nghiệm chứa 9,8 ml nước cất vô trùng làm tan đều mẫu đông khô. Hút toàn bộ dịch huyền phù sang ống nghiệm chứa 9,8 ml nước cất. Trộn đều và nhỏ vào 3 vị trí khác nhau (mỗi vị trí 3 giọt) trên môi trường thạch đĩa thích hợp và nghiêng cho dịch chảy đều dọc theo một hướng như hình vẽ:

3, Sau đó đậy nắp đĩa, bao quanh bằng parafil và để ở nhiệt độ thích hợp.

4, Cách đánh giá:

Rất tốt: ≥ 100 khuẩn lạc.

Khá: 50 – 100 khuẩn lạc.

Trung bình: 10-50 khuẩn lạc.

Kém: < 10 khuẩn lạc.

Không mọc.

Bảo quản được thực hiện với các mẫu từ khá trở lên. Tuy nhiên, có một số nấm sợi mà khuẩn lạc mọc tràn lan thì có thể đánh giá như sau: Nếu các khuẩn lạc mọc đều khắp trên bề mặt đĩa là tốt. Mẻ đông khô là thành công nếu như số khuẩn lạc mọc chiếm ít nhất là nửa bề mặt môi trường trong đĩa petri. Các mẫu có số lượng khuẩn lạc mọc dưới mức trên phải làm tăng mật độ bào tử trước khi đông khô như thay đổi môi trường sinh bào tử, hoặc chuẩn bị dịch huyền phù bào tử từ 3-4 ống nghiệm bào tử nấm sợi.

d. Bảo quản nấm sợi bằng phương pháp đông khô trực tiếp:

Phương pháp đông khô trực tiếp thực hiện tương tự như phương pháp đông khô đã trình bày ở trên và được thực hiện như sau:

Chuẩn bị:

1, Ống đông khô rửa sạch (sonic cleaner) trong 15 phút sau đó khử trùng 170oC trong 3 giờ.

2, Môi trường L-drying chuẩn có thành phần như sau:

Đệm phosphat: 0.1M : 100 ml.

Monosodium glutamat: 3 g

Adonitol: 1.5 g.

(Khử trùng ở 115oC/20 phút).

3, Ống thạch nghiêng (có thể đĩa petri) chứa bào tử nấm sợi, tuỳ theo từng chủng môi trường nuôi cấy mà thời gian thu bào tử thích hợp khác nhau (10-15 ngày).

Cách tiến hành:

1, Dùng pipet pasteur lấy khoảng 3-4 ml môi trường đã thanh trùng ở trên cho vào ống nghiệm chứa bào tử nấm sợi, dùng que cấy tạo dịch huyền phù bào tử nấm có mật độ cao nhất (đối với một số chủng có số lượng bào tử thấp thì có thể tạo dịch bào tử từ một vài ống thạch bào tử khác nhau).

2, Dùng pipet pasteur lấy dịch bào tử cho vào ống đông khô (0,2 ml), thông thường chuẩn bị 13 ống cho mỗi chủng, dán nhãn, ghi các thông tin cần thiết như số mã chủng, ngày bảo quản, môi trường và nhiệt độ thích hợp. Sau đó đậy bằng nút bông hay giấy bạc.

3, Đồng thời bật máy Dura-Dry, khi mức độ chân không đạt 45 minitor, nhiệt độ -75oC, lần lượt nối ampoule mẫu vào hệ thống manifold (chú ý khoá van chân không khi nối ampoule mẫu với tube manifold sau đó lại mở ra, để đảm bảo độ chân không cần thiết khi làm đông khô phải lần lượt đưa mẫu vào khi tín hiệu đèn chỉ thị cho phép). Khi độ chân không đạt 45-48 minitor, nhiệt độ -55oC tiến hành quá trình làm khô trong 3 giờ.

4, Hàn kín ampoule mẫu:

Khi máy cô Dura-Dry đang chạy để đảm bảo độ chân không cần thiết, lần lượt khoá van cho từng ampoule mẫu và tiến hành hàn với các mẫu này tại vị trí ống bị thắt. Dùng ngọn lửa gas để đốt nóng phần ống thắt cho đều các phía và xoay đều cho thuỷ tinh chảy bịt kín ống. Sau đó dùng ngọn lửa gas để cắt rời phần trên (nối với manifold) và phần dưới chứa mẫu. Hết đợt lại khoá các van của các ampoule mẫu tiếp theo và hàn lần lượt như trên.

Kiểm tra chất lượng ngay sau khi bảo quản:

– Để kiểm tra độ sống sót của mẫu nấm sợi bảo quản, có thể thực hiện theo cách đã được mô tả ở phần đông khô.

– Kiểm tra độ thuần chủng: các mẫu được cấy trên môi trường thích hợp và quan sát hình thái và các đặc điểm sinh học đặc trưng cần thiết để đánh giá khả năng tạp nhiễm và đặc tính sinh học.

– Thí nghiệm đánh giá nhanh thời gian bảo quản: các mẫu sau đông khô trực tiếp được giữ ở 37oC trong 2 tuần. Độ sống sót của mẫu bảo quản giảm trong 2 tuần ở 37oC tương đương với bảo quản 10 năm ở 4oC.

e. Bảo quản nấm sợi bằng phương pháp lạnh sâu -80 o C và nitơ lỏng (-196 o C):

Chuẩn bị:

1, Chuẩn bị dung dịch glycerol 10% (3 ml trong ống nghiệm) khử trùng ở 121 oC trong 15 phút. Ống nhựa nút xoáy (2 ml), rửa sạch trong sonic cleaner, khử trùng ở 170 oC trong 3 giờ.

2, Chuẩn bị mẫu nấm sợi trên môi trường thạch đĩa có lượng bào tử lớn.

Cách tiến hành:

1, Dùng pipet pasteur hút khoảng 0,3 ml glycerol đã thanh trùng vào ống nhựa đựng mẫu. Sau đó dùng dao vô trùng cắt lấy 1 miếng nhỏ môi trường chứa cả sợi và bào tử nấm sợi cho vào ống nhựa. Lượng glycerol đủ để phủ lên miếng thạch mẫu, đậy nút và bao băng parafil sau đó dán nhãn.

2, Mẫu trước tiên phải để ở 5oC (tạo điều kiện cho glycerol đi vào tế bào), sau đó được làm lạnh sâu tử 25oC xuống -55oC với tốc độ -1oC/phút. Trong trường hợp không có thiết bị làm lạnh thì có thể để -20oC trong 3 giờ, sau đó chuyển sang -80oC hay nitơ lỏng (-196oC).

Chú ý: Việc bảo quản theo phương pháp lạnh sâu thích hợp với hầu hết các nấm sợi sinh bào tử và tế bào có vách ngăn. Nhưng phương pháp này tỏ ra không thích hợp với các nấm sợi không sinh bào tử và không có vách ngăn. Trong trường hợp này cần nuôi cấy nấm sợi trên môi trường thích hợp để tạo bào tử. Nếu không khắc phục được thì phải tiến hành nuôi trên môi trường dịch thể để thu lấy sinh khối và giữ trong glycerol 10% như trên.

Đánh giá khả năng sống của mẫu bảo quản:

1, Làm tan mẫu (mẫu lấy từ tủ lạnh sâu -80oC hoặc nitơ lỏng -196oC) trong bể ổn nhiệt 37oC trong 2 phút.

2, Dùng que cấy lấy các miếng môi trường thạch đặt vào 3 vị trí khác nhau trên môi trường thạch đĩa thích hợp. Để ở nhiệt độ thích hợp và xem khả năng mọc sau thời gian thích hợp (2-4 ngày). Chú ý khi lấy mẫu cần lấy cả sợi nấm để đưa vào môi trường thạch đĩa.

Một số điều chú ý đối với bảo quản nấm sợi:

– Ảnh hưởng của ánh sáng với quá trình hình thành bào tử: Phần lớn trường hợp thì sự thành công của phương pháp bảo quản phụ thuộc vào số lượng bào tử. Ánh sáng là một tác nhân quan trọng đối với quá trình hình thành bào tử của nấm sợi, ánh sáng có bước sóng ngắn có tác dụng kích thích quá trình hình thành bào tử, ánh sáng gần vùng cực tím (3100 – 4000 nm) có tác dụng thay đổi màu sắc và kích thước khuẩn lạc.

– Thành phần môi trường: Nói chung các môi trường có thành phần dinh dưỡng nghèo thì thường cho lượng bào tử lớn.

– Tránh nhiễm tạp các con mạt (mite), các chủng nấm sợi lưu giữ thường bị mạt phá hoại. Đầu tiên chúng ăn chủng giống và làm hỏng, sau đó gây tạp nhiễm do mang bào tử và vi khuẩn trên cơ thể từ ống này sang ống khác. Vì lý do trên mà cần có biện pháp hạn chế mạt, thông thường các chủng giống phải được bảo quản ở nơi sạch, nhiệt độ 4-8oC.

Keywords searched by users: giữ giống vi sinh vật bằng glycerol

Pương Pháp Bảo Quản Giống Vi Sinh Vật Ppt
Pương Pháp Bảo Quản Giống Vi Sinh Vật Ppt
Một Số Phương Pháp Phổ Biến Sử Dụng Trong Bảo Quản Các Nhóm Vi Sinh Vật Cụ  Thể
Một Số Phương Pháp Phổ Biến Sử Dụng Trong Bảo Quản Các Nhóm Vi Sinh Vật Cụ Thể
Glycerol ( C3H8O3 ) - Jhd/Sơn Đầu Công Ty Tnhh Thương Mại Hóa Chất Và Thiết  Bị Hoa Việt
Glycerol ( C3H8O3 ) – Jhd/Sơn Đầu Công Ty Tnhh Thương Mại Hóa Chất Và Thiết Bị Hoa Việt
Đề Tài: Công Nghệ Sản Xuất Glycerol Bằng Phương Pháp Lên Men
Đề Tài: Công Nghệ Sản Xuất Glycerol Bằng Phương Pháp Lên Men
Tìm Hiểu Ứng Dụng Của Glycerin Trong Cuộc Sống? - Hóa Chất Việt Mỹ™ | Thế  Giới Hóa Chất | Vmcgroup
Tìm Hiểu Ứng Dụng Của Glycerin Trong Cuộc Sống? – Hóa Chất Việt Mỹ™ | Thế Giới Hóa Chất | Vmcgroup
Tổng Quan Về Quy Trình Sản Xuất Enzyme
Tổng Quan Về Quy Trình Sản Xuất Enzyme
Nghiên Cứu Men Vi Sinh Mới Phù Hợp Cho Nuôi Thủy Sản Mặn Lợ
Nghiên Cứu Men Vi Sinh Mới Phù Hợp Cho Nuôi Thủy Sản Mặn Lợ
Glycerin Công Nghiệp - C3H8O3 Chất Lượng| Hóa Chất Minh Chem
Glycerin Công Nghiệp – C3H8O3 Chất Lượng| Hóa Chất Minh Chem
Tìm Hiểu Ứng Dụng Của Glycerin Trong Cuộc Sống? - Hóa Chất Việt Mỹ™ | Thế  Giới Hóa Chất | Vmcgroup
Tìm Hiểu Ứng Dụng Của Glycerin Trong Cuộc Sống? – Hóa Chất Việt Mỹ™ | Thế Giới Hóa Chất | Vmcgroup
Glycerin Công Nghiệp - C3H8O3 Chất Lượng| Hóa Chất Minh Chem
Glycerin Công Nghiệp – C3H8O3 Chất Lượng| Hóa Chất Minh Chem
Glycerin Thực Vật: Chất Làm Mềm Da - Dưỡng Ẩm Da Sẵn Có Tại Nhà
Glycerin Thực Vật: Chất Làm Mềm Da – Dưỡng Ẩm Da Sẵn Có Tại Nhà
Glycerine (Glycerol, Glycerin) - Hóa Chất Công Nghiệp, Hóa Chất Cơ Bản
Glycerine (Glycerol, Glycerin) – Hóa Chất Công Nghiệp, Hóa Chất Cơ Bản

See more here: sixsensesspa.vn

Trả lời

Email của bạn sẽ không được hiển thị công khai. Các trường bắt buộc được đánh dấu *